课程名称： |
酶工程实验 |
英译名称： |
Enzyme engineering Experiment |
课程代码： |
071002Z106 |
适用专业： |
生物技术 |
课程学分： |
1 |
制定人： |
宗工理 |
审核人： |
|
二〇二二年七月
课程基本信息
课程名称 |
酶工程实验 |
课程学时 |
32 |
课程学分 |
1 |
授课学期 |
5 |
授课对象 |
专业 |
生物技术 |
学制 |
4 |
教材名称 |
《酶工程实验指导》 |
教材出版信息 |
自编教材 |
考核方式 |
□考试 ☑实验设计或实验报告 □其他 |
实验（实践）地点 |
生物医学科学学院实验教学中心 |
辅助实践场地 |
|
课程成绩 |
平时考核（％） |
30 |
单元测试（％） |
0 |
期末成绩（％） |
70 |
课程负责人及团队骨干（5人以内） |
姓名 |
性别 |
学历 |
学位 |
职称 |
从教时间 |
宗工理 |
男 |
博士研究生 |
博士 |
助理研究员 |
7年 |
付加芳 |
女 |
博士研究生 |
博士 |
副研究员 |
9年 |
曹广祥 |
男 |
博士研究生 |
博士 |
研究员 |
9年 |
张佩佩 |
女 |
博士研究生 |
博士 |
助理研究员 |
4年 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
课程教学大纲
一、课程介绍
1. 内容概述
《酶工程实验》是配合《酶工程》理论课开设的，与教材内容紧密结合，旨在通过实验强化学生对课堂内容的理解和掌握。其宗旨是加强学生基本技能训练和提高实验动手能力，培养和提高学生运用理论知识分析和解决实际问题的能力。《酶工程实验》开设了七个综合性设计实验，内容包括：蛋清溶菌酶的分离；蛋清溶菌酶的纯化；蛋清溶菌酶纯度以及分子量鉴定；凝胶包埋法固定溶菌酶；固定化溶菌酶酶活力及其回收率的测定；固定化溶菌酶最适作用 pH 变化的测定；固定化溶菌酶pH稳定性变化试验。涉及到酶工程课程中酶的提取、分离纯化、酶的固定化、酶活测定、固定化酶技术的基本知识，涉及到对酶工程实验室设备，包括蛋白电泳仪等设备的操作技能训练。
2. 学习目标
《酶工程实验》教学以学生在实验室实践为主，发挥学生的主体作用，教师只做必要的实验原理和注意事项的讲解，并注意引导学生拓展所学的内容。通过各类具体实验项目的训练，加强学生们对理论知识的认识，把学到的理论知识融会贯通，使得学生的基本实验能力及综合能力、基本实验方法、基本数据处理方法得以培训提高，最终达到掌握基本实验技能并培养学生创新能力的目的。培养学生的团队合作意识，自主发现问题解决问题的科研品质。
3. 先修知识技能
学生需要先完成生物化学、微生物学和分子生物学及其实验课程的学习，掌握基本理论知识和实验操作技能。
4. 学时安排
序号 |
名称 |
学时 |
1 |
蛋清溶菌酶的分离 |
4 |
2 |
蛋清溶菌酶的纯化 |
4 |
3 |
蛋清溶菌酶纯度以及分子量鉴定 |
4 |
4 |
凝胶包埋法固定溶菌酶 |
4 |
5 |
固定化溶菌酶酶活力及其回收率的测定 |
4 |
6 |
金属离子对溶菌酶酶活力的影响 |
4 |
7 |
温度对溶菌酶酶活力的影响 |
4 |
8 |
pH对溶菌酶酶活力的影响 |
4 |
二、课程教学计划
1. 教学方法
课程实验采用课堂教学与课后实验相结合的方式。课堂教学以学生自己动手操作为主，老师讲解、老师演示和现场指导为辅。部分实验组织部分同学提前做预实验、课后做延伸实验，增强学生的学习效果，提升学生的学习兴趣。
序号 |
名称 |
教学方法 |
1 |
蛋清溶菌酶的分离 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+现场演示+课后实验 |
2 |
蛋清溶菌酶的纯化 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+现场演示+课后实验 |
3 |
蛋清溶菌酶纯度以及分子量鉴定 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+课后实验 |
4 |
凝胶包埋法固定溶菌酶 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+课后实验 |
5 |
固定化溶菌酶酶活力及其回收率的测定 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+课后实验 |
6 |
金属离子对溶菌酶酶活力的影响 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+课后实验 |
7 |
固定化溶菌酶pH稳定性变化试验 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+现场演示+课后实验 |
8 |
固定化溶菌酶最适作用 pH 变化的测定 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+课后实验 |
2. 拓展资源
http://www.ilab-x.com/ 虚拟仿真实验
三、课程思政计划
1. 方法与内容
通过演示法向学生展示危险动作及其后果，让学生了解实验室安全要求，帮助学生树立安全意识。向学生演示实验室废弃物的处置程序，帮助学生树立环保理念。通过分组实验，要求大家集体完成具体的项目内容，培养学生的集体观念和合作精神。利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。
2. 实践与拓展
通过吸收学生进入任课教师的科研实验室，让学生参与科研项目，了解本课程的新进展和科学前沿。同时独立运用基因工程实验课中学到的理论知识和操作技能，独立自主完成科研任务，做到学以致用，理论与实践相结合。让学生切身了解中国科学家在本领域所做的工作，了解中国科技发展，和在国际科研领域的地位。
四、实践（实验）教学内容纲要
第一次实验 蛋清溶菌酶的分离
（一）目标与要求
1.知识目标：了解溶菌酶的性质、功能及应用。。
2.技能目标：了解并掌握从鸡蛋清中粗制备溶菌酶的原理及方法。
3.情感态度价值观：通过演示法向学生展示危险动作及其后果，让学生了解实验室安全要求，帮助学生树立安全意识。通过分组实验，要求大家集体完成具体的项目内容，培养学生的集体观念和合作精神。
（二）教学内容
1.重点讲练：
实验原理：溶菌酶(lysozyme)是一种有效的抗菌剂，全称为1,4-β-N-溶菌酶、粘肽 N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为 3.4%-4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源。溶菌酶具有耐热性，它在酸性条件下能经受较长时间的高温处理而不丧失酶活性，并且溶菌酶又有特别高的等电点。据此， 用热变性与等电点沉淀相结合的方法可除去大部分杂蛋白。 聚丙烯酸是一种多聚电解质，在特定的pH和离子强度下，能和某些蛋白质一起凝聚沉淀，而对多糖、核酸等物质则没有作用。溶菌酶在酸性条件下能与聚丙烯酸结合形成凝聚物，立即沉降粘附于容器底部，使溶菌酶既得到分离，又得到浓缩。
实验方法
1. 取一个新鲜鸡蛋，取蛋清并置于烧杯中，称取15g蛋清放入一个100ml的锥形瓶中。
2. 边搅拌边加入25mL 1%NaCl-0.05 mol.L-1 HCl溶液稀释，(此时溶液应不再粘稠）。
3. 加入100-150uL 20% HAc调至pH4.6（卵白蛋白等电点，占蛋清总蛋白75%）。
4. 置于80℃恒温水浴锅中加热3min，加热过程中要持续搅动。
5. 用流动水速冷后，用4层纱布过滤，沉淀物为热变性杂蛋白，溶菌酶在上清液中。注意事项
6. 将上述过滤液放入小烧杯中，慢速搅拌下滴加20mL 10%聚丙烯酸，凝聚物出现并粘附在烧杯底部,溶菌酶在凝聚物沉淀中，5000rpm，5min，弃去上层液体。
2.难点分析：等电点变性和聚丙烯酸沉淀。 要选取新鲜的鸡蛋作为原料，最好为 40 天内的新鲜鸡蛋，蛋清 pH 不应低于 8.0。要防止蛋清被细菌污染变质，不要混入蛋黄和其它杂质。
3.自学内容：PCR仪器使用说明书。
第二次实验 蛋清溶菌酶的纯化
（一）目标与要求
1.知识目标：了解并掌握离子交换层析法分离提纯蛋白质的一般原理。
2.技能目标：掌握握离子交换层析操作方法。
3.情感态度价值观：向学生演示实验室废弃物的处置程序，帮助学生树立环保理念。利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。
（二）教学内容
1.重点讲练：
实验原理：目前溶菌酶纯化方法主要有结晶、盐析、超滤、离子交换层析法等。结晶法耗时长，盐析法只能得到一定纯度的产物，酶比活力不高。超滤法的滤膜容易堵塞，收率低。 层析法是获得高纯度溶菌酶的理想方法，应用较多的是阳离子交换层析法。离子交换层析(IEC)是基于待分离物质的酸碱性、极性等差异，它们与离子交换剂的亲和力不同，通过离子之间的吸附和脱吸附而将各组分依次从层析柱中洗脱下来，从而达到分离目的。 CM Sepharose FF(快速羧甲基琼脂糖凝胶) 是弱酸性阳离子交换剂， 物理化学性质稳定、交换容量大、流速快、洗脱条件温和。
实验方法
1、将溶菌酶沉淀称重并溶解在5-10ml磷酸盐缓冲液(pH=6.2),8000rpm离心10min，除去沉淀。
2、装柱
取聚丙烯层析柱(3ml)，关闭层析柱出口。自顶部徐徐加入2ml CM Sepharose FF悬浮液，待凝胶颗粒沉降后，放出液体（不能长时间处于干燥状态）。用1ml ddH2O冲洗柱床，去除乙醇。冲洗2次。
3、加样
将5-10ml溶菌酶粗提液沿管壁缓缓加入CM Sepharose FF层析柱中，注意不要冲乱凝胶表层。
4、洗脱
用1ml ddH2O冲洗层析柱，以除去杂蛋白。冲洗3次，在白凹瓷板上，滴一滴考马斯亮蓝G-250，检测杂蛋白的洗脱情况，至颜色不再变蓝。之后，用1ml 0.5 M NaCl洗脱溶菌酶，用Ep管收集洗脱液, 至少接3 tube (T1、T2、T3)。用考马斯亮蓝G-250检查洗脱情况。
2.难点分析：终保持柱内液面高于凝胶表面，否则会导致凝胶变干或混入气泡，影响分离效果；层析时，应考虑层析介质对样品量的承载量。样品量过大，会导致吸附不完全， 并 直接影响到分离效果。
3.自学内容：聚丙烯层析柱的层析。
第三次实验 蛋清溶菌酶纯度以及分子量鉴定
（一）目标与要求
1.知识目标：理解SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)测定蛋白质纯度与分子量的原理与依据。
了解并掌握SDS-PAGE垂直板电泳分离蛋白质技术。
2.技能目标：掌握熟悉垂直板电泳操作原理和方法，凝胶染色与脱色方法
3.情感态度价值观：通过分组实验，要求大家集体完成具体的项目内容，培养学生的集体观念和合作精神。利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。
（二）教学内容
1.重点讲练：
实验原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
实验方法
1、胶板模型的安装：取干净的玻璃板（厚板和薄板）对合后，压到橡胶条压上，并夹牢固。（可加去离子水验证是否漏胶，后倒掉去离子水即可）（示范）
** 玻璃制胶版规格（0.75mm，按照以下配方，如有1.5mm玻璃板，用量加倍）
2、15%分离胶的制备（SDS-PAGE快速配制试剂盒A：304/AC：305） （教师准备）
3. 浓缩胶的制备：先吸去或倒掉已聚合好的分离胶上层的水，用水洗界面一次，再用滤纸吸干残留的水液。按下列配方制备浓缩胶溶液。混合后将其注入分离胶上端，立即插入梳子，应小心避免气泡。
4. 在浓缩胶聚合的同时，将样品与5×样品上样缓冲液(5×loading buffer)按比例(16μL＋ 4μL)混合，95℃加热5分钟得变性蛋白质。
5. 浓缩胶聚合完全后，小心地拔出梳子，用无离子水冲洗梳孔，将凝胶模板放入电泳槽上固定好，上下槽均加入1×电泳缓冲液，检查有无漏液，除去两玻璃板间凝胶底部的气泡。
6. 按次序上样：用微量进样器往凝胶梳孔中加样品混合液，12μL/孔，一孔加一个样品，同时安排已知分子量的标准物作对照，标准品做为阳性对照。
7.电泳：开始时浓缩胶电压为80V，溴酚蓝染料进入分离胶后，将电压增到120V，继续电泳至染料(溴酚蓝)到分离胶底部，断开电源。
8．染色：取下凝胶放入大培养皿，用考马斯蓝R-250染色液染色 ，最好放在摇床缓慢转动15-30min 。
9．脱色：先用蒸馏水洗去染料，再放入脱色液中脱色，更换2-3次，至条带清晰，背景呈淡蓝色。
2.难点分析：浓缩胶的制备：先吸去或倒掉已聚合好的分离胶上层的水，用水洗界面一次，再用滤纸吸干残留的水液。按下列配方制备浓缩胶溶液。混合后将其注入分离胶上端，立即插入梳子，应小心避免气泡。。
3.自学内容：SDS-PAGE模具的安装与检测漏胶。
第四次实验 凝胶包埋法固定溶菌酶
（一）目标与要求
1.知识目标：了解并掌握酶固定化的方法和原理。
2.技能目标：掌握凝胶包埋法固定溶菌酶技术。
3.情感态度价值观：利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。
（二）教学内容
1.重点讲练：凝胶包埋法是将酶或含酶菌体在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化菌体。常用的凝胶有琼脂、卡拉胶、海藻酸钙、明胶、聚丙烯酰胺等。固定化溶菌酶可广泛应用于人工肾或处理尿素废水。
实验方法
1.卡拉胶固定溶菌酶
将50 mg 溶菌酶溶于20 mL蒸馏水；另将0.7 g 卡拉胶缓慢加入30 mL、40 ℃的蒸馏水中搅拌至溶解；把两种溶液混合, 于40摄氏度，置冰箱30min 后取出, 将凝胶切成4 mm ×4 mm ×4 mm 小块, 泡在0. 3 mol/L KCl 溶液中, 置冰箱过夜后用蒸馏水洗涤2次。
2、海藻酸钠固定溶菌酶
将50 mg溶菌酶溶于50 mL、2% 海藻酸钠溶液(40 ℃) 中, 搅匀后用粗针头(1.5 mm ) 注射到150 mL、2% CaCl2 中, 置冰箱过夜后用蒸馏水洗涤2次。
计算每克凝胶包埋酶的毫克数
2.难点分析：合适直径的固定化颗粒 及海藻酸钠的溶解；固定化颗粒要尽量小。海藻酸钠的溶解：先预热水，非常缓慢的加海藻酸钠，并不断搅拌。该步骤是决定实验进展快慢的因素，一定强调注意控制速度。
3.自学内容：凝胶的制备。
第五次实验 固定化溶菌酶酶活力及其回收率的测定
（一）目标与要求
1.知识目标：解并掌握溶菌酶酶活力的测定原理与方法。
2.技能目标：掌握固定化酶方法。
3.情感态度价值观：利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。
（二）教学内容
1.重点讲练：溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖。对于革兰氏阳性菌（G+），如藤黄微球菌、枯草杆菌或溶壁微球菌等，与革兰氏阴性菌(G-)，如大肠杆菌、变形杆菌、痢疾杆菌、肺炎杆菌等都具有溶壁作用。固定化酶活力回收率是指固定化酶的活力与固定化的溶液酶的活力之百分比。
实验方法
1. 溶液酶活力测定（标准品）
（1）称取溶菌酶50mg，溶于5.0mL磷酸缓冲液中，用pH6.2磷酸缓冲液稀释200倍。
（2）LB培养基调零，精密量取25±0.1℃的底物悬浮液1ml，置1cm比色池中，在450nm的波长处测定吸收度，作为零秒的读数A0，然后精密量取25±0.1℃的溶菌酶溶液0.05ml(相当于溶菌酶2.5μg)，加到上述比色池中，迅速混匀，用秒表计时，至60秒时再测定吸收度A；
（3）同时精密量取磷酸盐缓冲液(pH6.2)0.05ml，同法操作，做为空白试验，测得零秒的读数A'0及60秒的读数A'。
（4）酶活计算：活力单位的定义是：在25℃，pH6.2，波长为450nm时，每分引起吸光度下降0.001为1个酶活力单位。
酶的活力单位数=△A450nm/t×0.001 （△A450：A0－A）－（A'0－A'）
2、固定化酶活力测定：
（1）精密量取25±0.1℃的底物悬浮液1ml，置1cm比色池中，在450nm的波长处测定吸收度，作为零秒的读数AI0
（2）另精密量取25±0.1℃的底物悬浮液1ml，精密量取0.5g的25±0.1℃的固定化酶样品(并计算溶菌酶含量)，加到底物悬浮液中，迅速混匀，用秒表计时，至60秒时，快速取样测定吸收度AI；
（3）同时精密量取磷酸盐缓冲液(pH6.2)0.05ml（代替固定化酶），同法操作，做为空白试验，测得零秒的读数AI'0及60秒的读数AI'。
（4）固定化酶活计算：
酶的活力单位数=△AI450nm/t×0.001 （△AI450：AI0－AI）－（AI'0－AI'）
计算相对酶活力：具有相同酶蛋白(或酶RNA)量的固定化酶活力与游离酶活力的比值
2.难点分析：酶活测定的规范性。
3.自学内容：溶壁微球菌的稀释。
第六次实验 金属离子对溶菌酶酶活力的影响
（一）目标与要求
1.知识目标：掌握考察金属离子对溶菌酶酶活力的影响原因。
2.技能目标：掌握考察金属离子对溶菌酶酶活力的影响的方法。
3.情感态度价值观：通过分组实验，要求大家集体完成具体的项目内容，培养学生的集体观念和合作精神。利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。
（二）教学内容
1.重点讲练：
实验原理
金属离子对酶活性的影响可分为两类：激活剂和抑制剂。有激活作用的金属离子主要有K+，Na+，Ca2+及Mg2+等。它们对于许多激酶和合成栈具有激活作用。在游离状态下，Ca2+ 、Co2+、Fe2+、Zn2+、Cu2+均使溶菌酶溶液有沉淀现象 。 Na+ 、K+对溶 菌 酶 活 性 有 轻微 激 活作 用 ，Mn2+ 、M g2+ 对溶菌酶活性无明显影响。
实验方法
1.溶菌酶的金属离子处理
分别向135 uL溶菌酶溶液中加入15uL Ca2+ 、 Cu2+、K+金属离子,使离子浓度为0.01mol／L，同时以不加金属离子的酶液作为对照，在室温下放置0.5h后，以不加金属离子的酶液活性为参照计算相对酶活。
2. 溶液酶活力测定（标准品）
（1）以LB培养基稀释溶壁微球菌至OD=0.6（教师准备）。
（2）以LB培养基调零，精密量取底物悬浮液1ml，置1cm比色池中，精密量取不同的处理后溶菌酶和未经处理的溶菌酶溶液各50uL，加到上述比色池中，迅速混匀，立即在450nm的波长处测定吸收度，作为零秒的读数A0，按下检测键的同时，用秒表计时，至60秒时再测定吸收度A；
（2）酶活计算：活力单位的定义是：pH6.2，波长为450nm时，每分引起吸光度下降0.001为1个酶活力单位。
酶的活力单位数=△A450nm/t×0.001 （△A450：A0－A）
计算在不同离子存在情况下，固定化溶菌酶的相对酶活
2.难点分析：酶活测定规范性，快速取样测定吸收度。
3.自学内容：溶菌酶作用机制。
第七次实验 固定化溶菌酶pH稳定性变化试验
（一）目标与要求
1.知识目标：掌握考察固定化溶菌酶pH值变化的原因。
2.技能目标：掌握考察固定化溶菌酶在不同pH值下活性的稳定性的方法。
3.情感态度价值观：通过稳定性实验，让学生理解科研的严谨性，培养科学家精神。利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。
（二）教学内容
1.重点讲练：
常规的溶菌酶在pH6左右时最稳定。在pH5.3～6.9范围内较稳定，相对酶活均在80％以上，pH7以上酶活性急剧下降。
酶经固定化后，稳定性一般比游离酶的稳定性好。主要表现在：
（1）对热的稳定性提高，可以耐受较高的温度。
（2）保存稳定性好，可以在一定条件下保存较长时间。
（3）对蛋白酶的抵抗性增强，不易被蛋白酶水解。
（4）对变性剂的耐受性提高，在尿素、有机溶剂和盐酸胍等蛋白质变性剂的作用下，仍可保留较高的酶活力等。
固定化酶处理
在25oC下，将固定化的溶菌酶浸泡在不同pH值的磷酸盐缓冲液中，放置0.5h。
3、固定化酶活力测定：
（1）精密量取25±0.1℃的底物悬浮液3ml，置1cm比色池中，在450nm的波长处测定吸收度，作为零秒的读数AI0，然后精密量取一定量的25±0.1℃的固定化酶样品(并计算溶菌酶含量)，加到底物悬浮液中，迅速混匀，用秒表计时，至60秒时，再测定该pH下的吸收度AI；
（3）同时精密量取磷酸盐缓冲液0.15ml，同法操作，做为空白试验，测得零秒的读数AI'0及60秒的读数AI'。
（4）不同pH下固定化酶活计算：
酶的活力单位数=△AI450nm/t×0.001 （△AI450：AI0－AI）－（AI'0－AI'）
比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质
相对酶活：不同PH酶活/最大值酶活*100%
（5）绘制不同pH下固定化酶的相对酶活曲线
2.难点分析：固定化溶菌酶稳定性曲线。
3.自学内容：相关试剂配制：
磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钠10.4g与磷酸氢二钠7.86g及乙二胺四乙酸二钠0.37g，加水溶解使成1000ml，调节pH值至4.2，5.2，6.2，7.2，8.2，9.2。
底物悬浮液的制备：称取溶酶小球菌(以溶壁微球菌（Micrococcus lysoleikticus）冻干粉为底物)15～20mg，加磷酸盐缓冲液(pH6.2)0.5～1ml,在研钵内研磨3分钟，再加磷酸盐缓冲液(pH6.2)适量，使总体积约为50ml，使悬浮液于25±0.1℃时，在450nm的波长处测得的吸收度为0.70±0.05(临用前配制)。。
第八次实验 固定化溶菌酶最适作用 pH 变化的测定
（一）目标与要求
1.知识目标：1、掌握测定溶菌酶最适作用 pH测定的原理;学习并掌握酶固定化后最适pH发生变化的原因。
2.技能目标：掌握测定溶菌酶最适作用 pH测定的方法。
3.情感态度价值观：利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。吸收学生进入任课教师的科研实验室，让学生参与科研项目，了解新进展和科学前沿。让学生切身了解中国科学家在本领域所做的工作，了解中国科技发展，和在国际科研领域的地位。
（二）教学内容
1.重点讲练：
酶固定化后，对底物作用的最适pH往往发生变化，酶-pH曲线常发生偏移。影响因素主要为载体的带电性质；酶催化反应产物的性质等。
固定化酶活力测定：
（1）精密量取25±0.1℃的不同pH的底物悬浮液3ml，置1cm比色池中，在450nm的波长处测定吸收度，作为零秒的读数AI0，然后精密量取一定量的25±0.1℃的固定化酶样品(并计算溶菌酶含量)，加到底物悬浮液中，迅速混匀，用秒表计时，至60秒时，再测定该pH下的吸收度AI；
（3）同时精密量取磷酸盐缓冲液0.15ml，同法操作，做为空白试验，测得零秒的读数AI'0及60秒的读数AI'。
（4）不同pH下固定化酶活计算：
酶的活力单位数=△AI450nm/t×0.001 （△AI450：AI0－AI）－（AI'0－AI'）
比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质
相对酶活：不同PH酶活/最大值酶活*100%
2.难点分析：绘制固定化溶菌酶的酶-pH曲线，标明固定化溶菌酶的最适pH。。
3.自学内容：相关试剂配制：
实验试剂：磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钠10.4g与磷酸氢二钠7.86g及乙二胺四乙酸二钠0.37g，加水溶解使成1000ml，调节pH值分别至4.2，5.2，6.2，7.2，8.2，9.2。
供试品溶液的制备：取标准品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加磷酸盐缓冲液适量使溶解，并稀释成每1ml中含溶菌酶50μg的溶液。
底物悬浮液的制备：称取溶酶小球菌(以溶壁微球菌（Micrococcus lysoleikticus）冻干粉为底物)15～20mg，加不同pH的磷酸盐缓冲液 0.5～1ml，在研钵内研磨3分钟，再加磷酸盐缓冲液适量，使总体积约为50ml，使悬浮液于25±0.1℃时，在450nm的波长处测得的吸收度为0.70±0.05(临用前配制)。。
课程考核大纲
一、考核形式
课程总成绩由实验报告和课堂操作组成。
二、考核内容
1. 平时考核
课堂操作，百分制，占课程总成绩30%。
2. 考试要求
实验报告，百分制，占课程总成绩70%。
