课程名称： |
基因工程实验 |
英译名称： |
Gene engineering Experiment |
课程代码： |
071002Z106 |
适用专业： |
生物技术 |
课程学分： |
1 |
制定人： |
付加芳 |
审核人： |
|
二〇二二年七月
课程基本信息
课程名称 |
基因工程实验 |
课程学时 |
32 |
课程学分 |
1 |
授课学期 |
6 |
授课对象 |
专业 |
生物技术 |
学制 |
4 |
教材名称 |
《基因工程实验指导》 |
教材出版信息 |
自编教材 |
考核方式 |
□考试 ☑实验设计或实验报告 □其他 |
实验（实践）地点 |
生物医学科学学院实验教学中心 |
辅助实践场地 |
|
课程成绩 |
平时考核（％） |
30 |
单元测试（％） |
0 |
期末成绩（％） |
70 |
课程负责人及团队骨干（5人以内） |
姓名 |
性别 |
学历 |
学位 |
职称 |
从教时间 |
付加芳 |
女 |
博士研究生 |
博士 |
副研究员 |
9年 |
曹广祥 |
男 |
博士研究生 |
博士 |
研究员 |
9年 |
宗工理 |
男 |
博士研究生 |
博士 |
助理研究员 |
7年 |
张佩佩 |
女 |
博士研究生 |
博士 |
助理研究员 |
4年 |
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课程教学大纲
一、课程介绍
1. 内容概述
实验课程包括重组蛋白异源表达的完整过程，包括目的基因的克隆，中间载体构建与验证，表达载体构建与验证，表达菌株的构建，重组蛋白的诱导表达，重组蛋白的纯化，以及重组蛋白的检测等。涉及到基因工程课程中工具酶、载体系统、核酸操作技术、蛋白操作技术、原核生物表达体系的的基本知识，涉及到对基因工程实验室设备，包括PCR仪、核酸电泳仪等设备的操作技能训练。
2. 学习目标
通过学习掌握如何利用大肠杆菌原核表达系统异源表达重组蛋白，了解基因工程的一般原理、环节和流程，掌握基因工程中几个关键试验的操作步骤。培养学生的团队合作意识，自主发现问题解决问题的科研品质。
3. 先修知识技能
学生需要先完成生物化学、微生物学和分子生物学及其实验课程的学习，掌握基本理论知识和实验操作技能。
4. 学时安排
序号 |
名称 |
学时 |
1 |
目的基因扩增 |
4 |
2 |
中间载体构建 |
4 |
3 |
中间载体验证 |
4 |
4 |
表达载体构建 |
4 |
5 |
表达菌株构建 |
4 |
6 |
重组蛋白诱导表达 |
4 |
7 |
重组蛋白纯化 |
4 |
8 |
重组蛋白检测 |
4 |
二、课程教学计划
1. 教学方法
课程实验采用课堂教学与课后实验相结合的方式。课堂教学以学生自己动手操作为主，老师讲解、老师演示和现场指导为辅。部分实验组织部分同学提前做预实验、课后做延伸实验，增强学生的学习效果，提升学生的学习兴趣。
序号 |
名称 |
教学方法 |
1 |
目的基因扩增 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+现场演示+课后实验 |
2 |
中间载体构建 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+现场演示+课后实验 |
3 |
中间载体验证 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+课后实验 |
4 |
表达载体构建 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+课后实验 |
5 |
表达菌株构建 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+课后实验 |
6 |
重组蛋白诱导表达 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+课后实验 |
7 |
重组蛋白纯化 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+现场演示+课后实验 |
8 |
重组蛋白检测 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+课后实验 |
2. 拓展资源
http://www.ilab-x.com/
基因工程药物的制备及生产虚拟仿真实验
白蛋白基因工程菌的构建虚拟仿真
基因工程技术制备门冬酰胺酶(冻干粉针)工艺的虚拟仿真实验
虚拟仿真基因工程方法制备ScFv抗体大实验
三、课程思政计划
1. 方法与内容
通过演示法向学生展示危险动作及其后果，让学生了解实验室安全要求，帮助学生树立安全意识。向学生演示实验室废弃物的处置程序，帮助学生树立环保理念。通过分组实验，要求大家集体完成具体的项目内容，培养学生的集体观念和合作精神。利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。
2. 实践与拓展
通过吸收学生进入任课教师的科研实验室，让学生参与科研项目，了解本课程的新进展和科学前沿。同时独立运用基因工程实验课中学到的理论知识和操作技能，独立自主完成科研任务，做到学以致用，理论与实践相结合。让学生切身了解中国科学家在本领域所做的工作，了解中国科技发展，和在国际科研领域的地位。
四、实践（实验）教学内容纲要
第一次实验 目的基因扩增
（一）目标与要求
1.知识目标：掌握PCR技术的常规操作和注意事项；学习利用PCR体外扩增DNA的基本原理和影响因素。 掌握PCR产物回收技术。
2.技能目标：掌握PCR仪器使用。
3.情感态度价值观：通过演示法向学生展示危险动作及其后果，让学生了解实验室安全要求，帮助学生树立安全意识。通过分组实验，要求大家集体完成具体的项目内容，培养学生的集体观念和合作精神。
（二）教学内容
1.重点讲练：PCR仪器、电泳仪、PCR回收试剂盒。PCR体系配制、PCR回收试剂盒。
2.难点分析： PCR反应的灵敏度很高，为了防止污染，使用的0.2ml的Eppendorf管的吸头都必须是新的、无污染的，实验操作需戴上橡胶手套，操作应尽可能在无菌操作台中进行。并且应设含除模板DNA所有其它成分的阴性对照。加试剂前，应短促离心10s，然后再打开试剂的管盖，以防污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。实验操作务必小心，如弃上清液时注意不要将沉淀一同弃去。电泳时最好使用新的电泳缓冲液， 以免影响电泳和回收效果。切胶时 紫外照射时间应尽量短， 以免对DNA造成损伤。如果回收率较低，可在胶充分溶解后检测pH值，如pH值大于7.5， 可向含有DNA的胶溶液中加10-30 µl 3 M醋酸钠（ pH5.2） 将pH值调到5-7之间。
3.自学内容：PCR仪器使用说明书。
第二次实验 中间载体构建
（一）目标与要求
1.知识目标：掌握DNA的TA克隆原理；掌握重组载体的蓝白斑筛选原理。
2.技能目标：掌握DNA的TA克隆方法。掌握重组载体的蓝白斑筛选方法。掌握热激转化技术。熟练微生物培养技术。
3.情感态度价值观：向学生演示实验室废弃物的处置程序，帮助学生树立环保理念。利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。
（二）教学内容
1.重点讲练：TA克隆和蓝白班筛选。TA 克隆载体即 T 载体，是目前克隆 PCR 产物最简便、快捷的方法。
2.难点分析：转化后的大肠杆菌必须在含有适当抗生素的LB培养基中进行培养，然后抽提质粒，抽提质粒所挑菌落必须是单菌落。转化效率与外源DNA浓度之间在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低，一般情况下，进行质粒转化时，质粒DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的1/10。IPTG 需用二甲基甲酰胺或者二甲基亚砜配制，需用锡纸封裹以防止受光照而破坏，并应存放在-20℃冰箱中。涂布的时候要涂布均匀。菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。
3.自学内容：氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞的原理及操作技术。
第三次实验 中间载体验证
（一）目标与要求
1.知识目标：通过本实验学习DNA的限制性内切酶处理技术。掌握重组载体的DNA酶切验证方法。
2.技能目标：掌握质粒的限制性内切酶酶切、双酶切技术，熟练DNA电泳技术。
3.情感态度价值观：通过分组实验，要求大家集体完成具体的项目内容，培养学生的集体观念和合作精神。利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。
（二）教学内容
1.重点讲练：质粒提取、限制性酶切和电泳检测。限制性内切酶能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA片段。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少个切口,就能产生多少个酶解片段，因此通过鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的区带数，就可以推断质粒DNA上酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段的差别。
2.难点分析：基因工程是微量操作技术，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的正确性，确认样品确实被加入反应体系。酶应在-20℃冰箱中保存，取酶的操作必须严格在冰浴条件下进行，用完后立即放回-20℃冰箱，不要将酶在冰浴中放置过久，或放在超过0℃以上的环境中，以防酶失活。酶切反应体系的溶液加完后，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底，注意：不可用旋涡混合器。此步操作时整个实验成败的关键，要防止错加、漏加。 为了避免交叉污染，各样品用不同的吸头，且每次取酶时务必换吸头，以免造成限制酶被污染。 限制酶中海油50%的甘油以防冻结，为防止星号活性，反应体系中的甘油，请尽量控制在10%以下。
3.自学内容：限制性内切酶的使用说明书。
第四次实验 表达载体构建
（一）目标与要求
1.知识目标： 掌握表达载体和克隆载体的特征与区别，掌握表达载体用于表达蛋白质的分子生物学原理。
2.技能目标：掌握载体的限制性内切酶处理技术。掌握载体的DNA连接技术。
3.情感态度价值观：利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。
（二）教学内容
1.重点讲练：低拷贝质粒的提取、限制性酶切和电泳检测。表达载体的特征。粘性末端表达载体的DNA连接技术。
2.难点分析：低拷贝载体操作时对菌体数量的要求。酶应在-20℃冰箱中保存，取酶的操作必须严格在冰浴条件下进行，用完后立即放回-20℃冰箱，不要将酶在冰浴中放置过久，或放在超过0℃以上的环境中，以防酶失活。酶切反应体系的溶液加完后，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底，注意：不可用旋涡混合器。此步操作时整个实验成败的关键，要防止错加、漏加。
3.自学内容：T4 DNA连接酶的使用说明书。
第五次实验 表达菌株构建
（一）目标与要求
1.知识目标：掌握表达菌株的感受态制备原理，热激转化的技术原理。
2.技能目标：掌握热激转化技术。熟练微生物培养技术。
3.情感态度价值观：利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。
（二）教学内容
1.重点讲练：感受态细胞的制备。热激转化的程序及其影响因素。
2.难点分析：转化后的大肠杆菌必须在含有适当抗生素的LB培养基中进行培养，然后抽提质粒，抽提质粒所挑菌落必须是单菌落。转化效率与外源DNA浓度之间在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低，一般情况下，进行质粒转化时，质粒DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的1/10。IPTG 需用二甲基甲酰胺或者二甲基亚砜配制，需用锡纸封裹以防止受光照而破坏，并应存放在-20℃冰箱中。涂布的时候要涂布均匀。菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。
3.自学内容：如何筛选验证重组表达菌株。
第六次实验 重组蛋白诱导表达
（一）目标与要求
1.知识目标：掌握诱导表达外源基因表达的基本原理。
2.技能目标：掌握利用IPTG诱导外源基因表达的常用方法。
3.情感态度价值观：通过分组实验，要求大家集体完成具体的项目内容，培养学生的集体观念和合作精神。利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。
（二）教学内容
1.重点讲练：无菌操作、IPTG的添加时间点、诱导时间控制。
2.难点分析：在进行诱导实验中，要注意以空载体的BL21菌株以及IPTG诱导前的含有重组子的BL21菌株作为对照。 IPTG诱导的终浓度为0.3~1mmol/L。 诱导后的培养时间一般不超过3h。
3.自学内容：大肠杆菌表达菌株BL21的特征，与克隆菌株DH5a的区别。
第七次实验 重组蛋白纯化
（一）目标与要求
1.知识目标：掌握镍亲和层析的原理。掌握重组蛋白的标签纯化原理，包括组氨酸标签。
2.技能目标：掌握用镍亲和层析方法从诱导菌体蛋白中纯化重组蛋白。
3.情感态度价值观：通过超声波破碎的展示实验，让学生理解科研的严谨性，培养科学家精神。利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。
（二）教学内容
1.重点讲练：演示菌体裂解、上柱、洗涤和洗脱的过程和注意细节。
2.难点分析：在纯化过程中，预冷的TBS缓冲溶液可减少蛋白质的非特异性结合和微生物的代谢。 镍离子有六个螯合价位，Ni-NTA螯合了四价，剩余两价；而Ni-IDA螯合三价，剩余三价。因此Ni-IDA Agarose结合作用力要比Ni-NTA Agarose强，在同样条件下Ni-IDA Agarose的载量要比Ni-NTA Agarose高，而且洗脱杂质和目标蛋白所用的缓冲液中咪唑浓度更高；但Ni-NTA Agarose更稳定，耐受更强的还原剂，镍离子更不易脱落。 纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速保持在0.5ml/min为宜。
3.自学内容：了解自动化的柱层析设备AKTA。
第八次实验 重组蛋白检测
（一）目标与要求
1.知识目标：掌握SDS-PAG检测蛋白质纯度和浓度的原理，掌握蛋白质考马斯亮蓝染色原理。
2.技能目标：掌握利用SDS-PAGE检测表达蛋白的浓度，确定蛋白质的相对分子量的技术方法。掌握蛋白质染色技术。
3.情感态度价值观：利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。吸收学生进入任课教师的科研实验室，让学生参与科研项目，了解新进展和科学前沿。让学生切身了解中国科学家在本领域所做的工作，了解中国科技发展，和在国际科研领域的地位。
（二）教学内容
1.重点讲练：SDS-PAGE凝胶配制、上样、染色。
2.难点分析：根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度。 丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。 pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
3.自学内容：蛋白质电泳装置使用说明书。
课程考核大纲
一、考核形式
课程总成绩由实验报告和课堂操作组成。
二、考核内容
1. 平时考核
课堂操作，百分制，占课程总成绩30%。
2. 考试要求
实验报告，百分制，占课程总成绩70%。
