课程名称： |
分子生物学实验 |
英译名称： |
Molecular Biology Experiment |
课程代码： |
071002Z104 |
适用专业： |
生物技术 |
课程学分： |
1 |
制定人： |
曹广祥 |
审核人： |
|
二〇二二年七月
课程基本信息
课程名称 |
分子生物学实验 |
课程学时 |
32 |
课程学分 |
1 |
授课学期 |
5 |
授课对象 |
专业 |
生物技术 |
学制 |
4 |
教材名称 |
《分子生物学实验指导》 |
教材出版信息 |
自编教材 |
考核方式 |
□考试 ☑实验设计或实验报告 □其他 |
实验（实践）地点 |
生物医学科学学院实验教学中心 |
辅助实践场地 |
|
课程成绩 |
平时考核（％） |
30 |
单元测试（％） |
0 |
期末成绩（％） |
70 |
课程负责人及团队骨干（5人以内） |
姓名 |
性别 |
学历 |
学位 |
职称 |
从教时间 |
曹广祥 |
男 |
博士研究生 |
博士 |
研究员 |
9年 |
付加芳 |
女 |
博士研究生 |
博士 |
副研究员 |
9年 |
宗工理 |
男 |
博士研究生 |
博士 |
助理研究员 |
7年 |
张佩佩 |
女 |
博士研究生 |
博士 |
助理研究员 |
4年 |
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课程教学大纲
一、课程介绍
1. 内容概述
实验课程包括分子生物学的常规核酸操作技术和蛋白质操作技术，包括质粒提取技术，基因组提取，DNA电泳技术，限制性酶切技术，质粒转化技术，SDS-PAGE电泳技术，PCR扩增技术以及DNA回收技术等。涉及到分子生物学课程中核酸操作技术和蛋白操作技术、的的基本知识，涉及到对分子生物学和微生物学实验室设备，包括PCR仪、核酸电泳仪、蛋白电泳仪、离心机、移液器、凝胶成像系统、超净工作台、摇床和培养箱等设备的操作技能训练。
2. 学习目标
通过学习掌握分子生物学的常规核酸操作技术和蛋白质操作技术，掌握几个分子生物学基础实验技术的操作步骤。培养学生的团队合作意识，自主发现问题解决问题的科研品质。
3. 先修知识技能
学生需要先完成《生物化学》和《微生物学》及其实验课程的学习，掌握基本理论知识和实验操作技能。
4. 学时安排
序号 |
名称 |
学时 |
1 |
质粒提取 |
4 |
2 |
基因组提取 |
4 |
3 |
DNA电泳 |
4 |
4 |
限制性酶切 |
4 |
5 |
质粒转化 |
4 |
6 |
SDS-PAGE电泳 |
4 |
7 |
PCR扩增 |
4 |
8 |
DNA回收 |
4 |
二、课程教学计划
1. 教学方法
课程实验采用课堂教学、课前预习与课后实验相结合的方式。课堂教学以学生自己动手操作为主，老师讲解、老师演示和现场指导为辅。部分实验组织部分同学提前做预实验、课后做延伸实验，增强学生的学习效果，提升学生的学习兴趣。
序号 |
名称 |
教学方法 |
1 |
质粒提取 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+现场演示+课后实验 |
2 |
基因组提取 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+现场演示+课后实验 |
3 |
DNA电泳 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+课后实验 |
4 |
限制性酶切 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+课后实验 |
5 |
质粒转化 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+课后实验 |
6 |
SDS-PAGE电泳 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+课后实验 |
7 |
PCR扩增 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+现场演示+课后实验 |
8 |
DNA回收 |
课堂操作+PPT讲解+现场指导+现场演示+课后实验 |
2. 拓展资源
http://www.ilab-x.com/
分子生物学实验室基本技能操作（可燕 上海中医药大学）
基于创新思维训练的分子生物学综合设计性实验虚拟仿真教学项目（曾柱 贵州医科大学）
三、课程思政计划
1. 方法与内容
通过课堂讲授向学生讲解展示危险动作及其后果，让学生了解实验室安全要求，帮助学生树立安全意识。通过演示法向学生演示实验室废弃物的处置程序，帮助学生树立环保理念。通过分组实验，要求大家集体完成具体的项目内容，培养学生的集体观念和合作精神。利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。
2. 实践与拓展
通过吸收学生进入任课教师的科研实验室，让学生参与科研项目，了解本课程的新进展和科学前沿。让学生切身了解中国科学家在本领域所做的工作，了解中国科技发展，和在国际科研领域的地位。
四、实践（实验）教学内容纲要
第一次实验 质粒提取
（一）目标与要求
1.知识目标：了解质粒在分子生物学研究的作用；掌握碱裂解法从大肠杆菌中提取质粒的原理。
2.技能目标：掌握碱裂解法从大肠杆菌中提取质粒的实验技术。
3.情感态度价值观：通过课堂讲授向学生讲解展示危险动作及其后果，让学生了解实验室安全要求，帮助学生树立安全意识。通过演示法向学生演示实验室废弃物的处置程序，帮助学生树立环保理念。通过分组实验，要求大家集体完成具体的项目内容，培养学生的集体观念和合作精神。
（二）教学内容
1.重点讲练：质粒通常以超螺旋闭合环状形式存在于宿主细胞中，在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。然后通过吸附柱纯化可回收质粒DNA。
2.难点分析：危险因素：菌液、P2、P3。危险性：菌液含大量活菌，P2、P3具有腐蚀性，请带手套，在教师指导下操作
3.自学内容：离心柱式质粒提取试剂盒的使用说明书。
第二次实验 基因组提取
（一）目标与要求
1.知识目标：学习并掌握CTAB法提取DNA的原理。掌握基因组的特征。
2.技能目标：掌握CTAB法提取细菌基因组DNA的实验技术。
3.情感态度价值观：通过课堂讲授向学生讲解展示危险动作及其后果，让学生了解实验室安全要求，帮助学生树立安全意识。通过分组实验，要求大家集体完成具体的项目内容，培养学生的集体观念和合作精神。
（二）教学内容
1.重点讲练：蛋白酶K的作用可使组织细胞破裂，同时将蛋白质分解，释放出DNA。DNA与CTAB结合后，通过氯仿抽提，可进一步与脂类、蛋白质及多糖分离。再经过异丙醇沉淀和70%乙醇的漂洗去除CTAB等杂质，即可获得较纯的DNA。
2.难点分析：蛋白酶消化、氯仿萃取、异丙醇沉淀、洗涤。危险因素：菌液、氯仿。危险性：菌液含大量活菌，氯仿为危险化学试剂，请带手套，不能吸入，在教师指导下操作。
3.自学内容：基因组和质粒DNA的特征和区别，两者在提取过程中的差异。
第三次实验 DNA电泳
（一）目标与要求
1.知识目标：学习掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理；了解电泳仪的运行原理。了解琼脂糖的作用及其原理。学习如何利用DNA琼脂糖凝胶电泳分离鉴定质粒及基因组DNA。
2.技能目标：掌握核酸电泳技术。
3.情感态度价值观：通过分组实验，要求大家集体完成具体的项目内容，培养学生的集体观念和合作精神。利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。
（二）教学内容
1.重点讲练：核酸电泳技术的原理，DNA富含碱基，碱性条件下带负电，在电场作用下向正极移动。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。琼脂糖链形成螺旋纤维，然后再聚集成20~30 nm的超螺旋结构，在凝胶中可构成50~200 nm的三维筛孔通道。不同分子量大小的DNA在凝胶中所受摩擦阻力不同，因此在电泳时可以被分开。电泳仪的运行原理。琼脂糖的作用原理。
2.难点分析：核酸电泳的主要步骤包括琼脂糖凝胶配制、上样、电泳、染色、观察。危险因素： GelRed核酸染料、电泳设备。危险性： GelRed核酸染料具有低致突变作用，请带手套，在教师指导下操作。电泳设备在运行时不要触碰，小心电击。
3.自学内容：电泳仪的使用说明书。
第四次实验 限制性酶切
（一）目标与要求
1.知识目标：通过本实验学习DNA的限制性内切酶处理技术。
2.技能目标：掌握质粒的限制性内切酶酶切、双酶切技术，熟练DNA电泳技术。
3.情感态度价值观：通过分组实验，要求大家集体完成具体的项目内容，培养学生的集体观念和合作精神。利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。
（二）教学内容
1.重点讲练：质粒提取、限制性酶切和电泳检测。限制性内切酶能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA片段。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少个切口,就能产生多少个酶解片段，因此通过鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的区带数，就可以推断质粒DNA上酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段的差别。
2.难点分析：基因工程是微量操作技术，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的正确性，确认样品确实被加入反应体系。酶应在-20℃冰箱中保存，取酶的操作必须严格在冰浴条件下进行，用完后立即放回-20℃冰箱，不要将酶在冰浴中放置过久，或放在超过0℃以上的环境中，以防酶失活。为了避免交叉污染，各样品用不同的吸头，且每次取酶时务必换吸头，以免造成限制酶被污染。 限制酶中海油50%的甘油以防冻结，为防止星号活性，反应体系中的甘油，请尽量控制在10%以下。
3.自学内容：限制性内切酶的使用说明书。
第五次实验 质粒转化
（一）目标与要求
1.知识目标：掌握表达菌株的感受态制备原理，热激转化的技术原理。
2.技能目标：掌握热激转化技术。熟练微生物培养技术。
3.情感态度价值观：利用课后实验环节，通过任务驱动法培养学生的自主学习兴趣和主观能动性。
（二）教学内容
1.重点讲练：感受态细胞的制备。热激转化的程序及其影响因素。
2.难点分析：转化后的大肠杆菌必须在含有适当抗生素的LB培养基中进行培养。转化效率与外源DNA浓度之间在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低，一般情况下，进行质粒转化时，质粒DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的1/10。涂布的时候要涂布均匀。菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。
3.自学内容：转化效率的影响因素，转化率的计算方法。
第六次实验 SDS-PAGE电泳
（一）目标与要求
1.知识目标：掌握SDS-PAG检测蛋白质纯度和浓度的原理，掌握蛋白质考马斯亮蓝染色原理。
2.技能目标：掌握利用SDS-PAGE检测表达蛋白的浓度，确定蛋白质的相对分子量的技术方法。掌握蛋白质染色技术。
3.情感态度价值观：吸收学生进入任课教师的科研实验室，让学生参与科研项目，了解新进展和科学前沿。
（二）教学内容
1.重点讲练：SDS-PAGE凝胶配制、上样、染色。
2.难点分析：根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度。 丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。 pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。
3.自学内容：蛋白质电泳装置使用说明书。
第七次实验 PCR扩增
（一）目标与要求
1.知识目标：；学习利用PCR体外扩增DNA的基本原理和影响因素。掌握PCR技术的常规操作和注意事项
2.技能目标：掌握PCR仪器使用。
3.情感态度价值观：通过演示法向学生展示危险动作及其后果，让学生了解实验室安全要求，帮助学生树立安全意识。通过分组实验，要求大家集体完成具体的项目内容，培养学生的集体观念和合作精神。
（二）教学内容
1.重点讲练：PCR仪器、电泳仪。PCR体系配制。
2.难点分析： PCR反应的灵敏度很高，为了防止污染，使用的0.2ml的Eppendorf管的吸头都必须是新的、无污染的，实验操作需戴上橡胶手套，操作应尽可能在无菌操作台中进行。并且应设含除模板DNA所有其它成分的阴性对照。加试剂前，应短促离心10s，然后再打开试剂的管盖，以防污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
3.自学内容：PCR仪器使用说明书。
第八次实验 DNA回收
（一）目标与要求
1.知识目标：掌握DNA回收技术的原理，琼脂糖凝胶的融化，DNA吸附与解吸附。
2.技能目标：掌握DNA回收技术。
3.情感态度价值观：通过演示法向学生展示危险动作及其后果，让学生了解实验室安全要求，帮助学生树立安全意识。通过分组实验，要求大家集体完成具体的项目内容，培养学生的集体观念和合作精神。
（二）教学内容
1.重点讲练： PCR回收试剂盒，DNA回收的原理。
2.难点分析：电泳时最好使用新的电泳缓冲液， 以免影响电泳和回收效果。切胶时 紫外照射时间应尽量短， 以免对DNA造成损伤。如果回收率较低，可在胶充分溶解后检测pH值，如pH值大于7.5， 可向含有DNA的胶溶液中加10-30 µl 3 M醋酸钠（ pH5.2） 将pH值调到5-7之间。
3.自学内容：DNA凝胶回收试剂盒使用说明书。
课程考核大纲
一、考核形式
课程总成绩由实验报告和课堂操作组成。
二、考核内容
1. 平时考核
课堂操作，百分制，占课程总成绩30%。
2. 考试要求
实验报告，百分制，占课程总成绩70%。
